1568年8月，首位宗教領袖卡內羅(D.Belchi or Carnei ro）來澳，為澳門第一任主教。1575年1月23日，澳門教區作為遠東第一個主教區正式成立，這樣，澳門又逐漸成為西方在中國的文化和宗教中心。到了1621年，全澳已有人囗兩萬多人，開設有鑄炮廠、船廠以及能生產軍械火藥的手工業作坊。不過，此時的地方行政及司法權力，仍然由中國掌握，直至十九世紀中葉。
1842年宣宗道光二十二年，中英鴉片戰爭結束後，清政府腐敗無能，國勢日頹。1849年道光二十九年，澳門總督亞馬留（Joao Ferreira do Amaral)單方面宣佈將澳門改為自由港，不准在澳門的中國海關和稅館繼續存在，中國官員及家屬被迫全部撤離。從此，葡萄牙佔領澳門，不僅停止向中國政府繳納租金和關稅，反過來向澳門華人徵收田賦，正式取得了澳門的行政權，並向東北擴展地界。因而激起華人反抗，同年八月發生亞馬留被華人青年斬殺事件，中葡（澳）關係一時緊張。澳葡仍然於1851年佔領乙水仔，
1864年佔領路環，設立「海島鎮行政局”。
1862年穆宗同治元年，葡派澳督基馬拉士（Lsidoro Francisco Guimaraes)到北京同清政議約，被清廷拒見，只有住在法國使館內，由法國大使代表洽約。初時，清提出收回澳門，恢復在澳門設官衙收租稅。但葡要先解決亞馬留被殺問題，經過一番爭持，最後達成協議，清政府可以繼續在澳門設官府衙門，但不得再提收租。法大使代表葡國同清簽約，葡未簽字。1864年同治三年，葡派遣使節到北京換文，清發現條約的中文本予法文本不符，法文本不是將澳們規定為廣東省的一部分，而是已經脫離中國的地區，結果換文拖下來。直至1887年光緒十三年三月，葡利用清政府派拱北稅務司金登千（英國人）前往里斯本交涉鴉片走私問題之機，舊事重提，搞了一個「中葡會議草約”。同年十二月，中葡簽訂「和好通商條約”，被迫確認「葡國永遠管理澳門”，但同時規定，「現經商定，俟兩國派員妥為會訂界址，再行特立專約”。此後雙方多次會商，均無結果。
