1568年8月,首位宗教領袖卡內羅(D.Belchi or Carnei ro)來澳,為澳門第一任主教。1575年1月23日,澳門教區作為遠東第一個主教區正式成立,這樣,澳門又逐漸成為西方在中國的文化和宗教中心。到了1621年,全澳已有人囗兩萬多人,開設有鑄炮廠、船廠以及能生產軍械火藥的手工業作坊。不過,此時的地方行政及司法權力,仍然由中國掌握,直至十九世紀中葉。
1842年宣宗道光二十二年,中英鴉片戰爭結束後,清政府腐敗無能,國勢日頹。1849年道光二十九年,澳門總督亞馬留(Joao Ferreira do Amaral)單方面宣佈將澳門改為自由港,不准在澳門的中國海關和稅館繼續存在,中國官員及家屬被迫全部撤離。從此,葡萄牙佔領澳門,不僅停止向中國政府繳納租金和關稅,反過來向澳門華人徵收田賦,正式取得了澳門的行政權,並向東北擴展地界。因而激起華人反抗,同年八月發生亞馬留被華人青年斬殺事件,中葡(澳)關係一時緊張。澳葡仍然於1851年佔領乙水仔,
1864年佔領路環,設立「海島鎮行政局”。
1862年穆宗同治元年,葡派澳督基馬拉士(Lsidoro Francisco Guimaraes)到北京同清政議約,被清廷拒見,只有住在法國使館內,由法國大使代表洽約。初時,清提出收回澳門,恢復在澳門設官衙收租稅。但葡要先解決亞馬留被殺問題,經過一番爭持,最後達成協議,清政府可以繼續在澳門設官府衙門,但不得再提收租。法大使代表葡國同清簽約,葡未簽字。1864年同治三年,葡派遣使節到北京換文,清發現條約的中文本予法文本不符,法文本不是將澳們規定為廣東省的一部分,而是已經脫離中國的地區,結果換文拖下來。直至1887年光緒十三年三月,葡利用清政府派拱北稅務司金登千(英國人)前往里斯本交涉鴉片走私問題之機,舊事重提,搞了一個「中葡會議草約”。同年十二月,中葡簽訂「和好通商條約”,被迫確認「葡國永遠管理澳門”,但同時規定,「現經商定,俟兩國派員妥為會訂界址,再行特立專約”。此後雙方多次會商,均無結果。